Nat Commun | IFNγ信号的缺失激活ILC2介导的自发性肺纤维化

       肺纤维化（PF）是一种以炎症和胶原在肺泡间质沉积为特征的疾病，会导致呼吸困难和致命后果。迄今为止，已经开发了几种PF小鼠模型，包括博来霉素诱导和TGFβ过表达模型，但使用该模型很难研究PF不可逆进展的机制。

       作者发现缺乏获得性免疫系统和IFNγ信号传导的Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠的肺部随着年龄的增长而变白。Masson染色表明这些小鼠肺部发生了纤维化，且在15周时表现出细胞浸润和纤维蛋白积累，20周后观察到明显的纤维化。基于以上观察结果，作者决定评估三个不同年龄组小鼠的炎症和纤维化程度：<10、10-20和>20周龄。作者检测了119只Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠BALF中细胞的数量，显示10-20周组的BALF细胞数量显著增加，>20周组的雄性高于雌性，此外，纤维化评分表明10周后纤维化评分显著增加，20周后雄性分数高于雌性。尽管报道称老年Rag2-/-小鼠会发生自发性PF，但在22周的WT小鼠或Rag2-/-或Ifngr1-/-单基因敲除小鼠中未观察到明显的纤维化。

Result 2.从临床角度评估Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠的病理生理学

       作者检查了Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠与人PF共有的临床特征，发现Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠的肺部未发生蜂窝状变化，但纤维蛋白在这些小鼠的肺泡中积累明显。与炎症期小鼠相比，30-31 周的 Ifngr1-/-Rag2-/- 小鼠血清中的 SP-D 水平显著增加、SpO2水平显著降低；与14周小鼠相比，33周的Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠的Cst显著降低。这些数据共同表明，除一些组织学差异外，Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠的肺功能临床指标与人类PF患者相似。IPF 对皮质类固醇治疗有抵抗力，在 Ifngr1-/-Rag2-/- 小鼠的炎症或纤维化阶段连续施用 4 周皮质类固醇治疗，结果显示炎症组中 BALF 中的炎症细胞数量减少，与人类IPF结果一致。

Result 3.ILC2 和 ST2-KLRG1- 细胞随着 PF 进展而增加

       阐明炎症期的细胞动力学对了解纤维化的发展很重要，作者通过scRNAseq分析了Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠中完整期、炎症期和纤维化期的肺细胞，确定了 24 种细胞类型，并对数据按三个阶段细分。首先分析成纤维细胞，结果显示成纤维细胞2的频率随着疾病的进展而增加，同时二者群体间的差异表达分析表明成纤维细胞 2 具有致病性状，因其纤维化因子 Col1a1、Col1a2、Col3a1、Timp1 和 Dcn 表达增加。

       接着分析Ptprc 阳性免疫细胞，发现ILC、嗜碱性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞在炎症和纤维化阶段增加。由于据报道巨噬细胞和 ILC 参与人 IPF，作者随后对 Ifngr1-/-Rag2-/- 小鼠肺部的样本进行流式细胞术分析，发现在巨噬细胞中，Siglec-FlowCD11c+巨噬细胞（间质巨噬细胞）的数量在炎症期和纤维化期均增加；而在CD45+谱系-Thy-1+群体（主要由ILC组成）中，发现炎症期ILC2的数量显著增加,ST2-KLRG1-细胞的数量在炎症期和纤维化期均显著增加。这些结果共同表明，间质巨噬细胞、ILC2 和 ST2-KLRG1- 细胞可能参与 PF 的发病机制。此外，比较 24 周 Ifngr1-/-Rag2-/- 纤维化小鼠正常和病理区域的 ILC2 分布表明， ILC2 分散在整个纤维化区域且ILC2数量显著增加，这表明 ILC2 与纤维化之间存在密切联系。

Result 4.ILC 对 PF 进展是必不可少的

       由于 IL2Rγ 信号转导对于所有 ILC 亚群的发育至关重要，因此作者建立了 Ifngr1-/-Il2rg-/-Rag2-/- 小鼠，且这些小鼠未发生纤维化。作者将来自Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠或Ifngr1-/-Il2rg-/-Rag2-/-小鼠的骨髓转移到ILCs缺陷的Il2rg-/-Rag2-/-小鼠中，并在骨髓转移后21-31周进行评估，结果显示在Ifngr1-/-Il2rg-/-Rag2-/-移植小鼠中未检测到纤维化，且这些小鼠的ILC2和ST2-KLRG1-细胞的数量显著减少，Siglec-FlowCD11c+巨噬细胞的数量趋于减少。这些数据表明，ILC2 和 ST2-KLRG1- 细胞均在 Ifngr1-/-Rag2-/- 小鼠的 PF 发展中起作用。

Result 5.ILC2 和 ILC3 亚群随着 PF 进展而增加

       为了确定ILC中的哪些细胞主要导致纤维化，无监督聚类将ILC分为8个亚簇，并将簇 0 和 7 确定为 ILC1;簇 2、3、4 和 6 作为 ILC2;簇 1 和 5 作为 ILC3。簇 5 ILC3 显示 Ccr6、Cd4、Ccr7 和 Tnfsf4 表达升高，而簇 1 ILC3 显示 Ccr6 表达但缺乏 Cd4 和 Ncr1 表达。亚群进展阶段的组成分析表明，ILC3（簇 1）和 ILC2（簇 6）都从炎症期开始增加。根据 Thy1、Il1rl1和 Klrg1 的表达，簇 1 ILC3 可能是 CD45+谱系-Thy-1+ST2-KLRG1- 细胞。由于簇 1 ILC3 中ILC3 相关基因的表达低于典型的簇 5 ILC3，所以簇 1 ILC3被称为 ILC3 样细胞。鉴于流式细胞术和 scRNA-seq 结果均表明 ILC3 样细胞参与 PF 的发病机制，作者接下来通过敲除 Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠的 Rorc 表达来耗尽 ILC3，结果表明Ifngr1-/-Rorc-/-Rag2-/- 小鼠中 ILC3 样细胞的数量和频率显著降低，且这些小鼠未发生纤维化，同时在炎症期的BALF 中 ILC2 急剧下降。综上所述，这些结果表明，ILC3的缺失和ILC2的功能障碍可能是Ifngr1-/-Rorc-/-Rag2-/-小鼠未发生纤维化的原因。

Result 6.IL-33介导的ILC2s激活对于PF进展是必不可少的

       为了研究 ILC2 在 PF 中的参与，作者重点研究了纤维化炎症期出现在肺部的第 6 类 ILC2，结果表明22周的小鼠纤维化区域Il33的表达增加。由于Il1rl1 在 ILC2 中表达受到限制，因此生成了 Ifngr1-/-Rag2-/-Il33gfp/gfp 小鼠来检查 IL-33-ILC2 轴在 PF 中的重要性。Ifngr1-/-Rag2-/-Il33-/- 小鼠中的 Il33 耗竭显著抑制了纤维化的自发发作和 BALF 中 ILC2 的浸润，这表明IL-33对于Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠PF的发展是必不可少的。

       为了阐明PF中IL-33的细胞来源，作者生成了Ifngr1-/-Rag2-/-Il33gfp/+报告小鼠。近 80% 的 IL-33/GFP+ 细胞是上皮细胞，然而，在成纤维细胞中也观察到IL-33/GFP的表达，并且在22周的小鼠的成纤维细胞中表达升高。从Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠分选的这些细胞中IL-33表达的定量显示，与纤维化相关的成纤维细胞中IL-33增加。IL-33、GATA3、PDGFRα和EpCAM的免疫荧光染色显示，IL-33 阳性细胞与 ILC2 一起存在于纤维化区域。在切片中量化每个 ROI中 IL33+ 细胞和 ILC2 的数量，显示纤维化期间 IL33+ 细胞和 ILC2 均增加。这些均表明，来自成纤维细胞和上皮细胞的IL-33激活的ILC2对Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠的纤维化发展很重要。

Result 7.IL-33 激活的 ILC2 上调成纤维细胞产生的胶原蛋白

       由于ILC2对纤维化的诱导很重要，作者从 WT小鼠中分离出ILC2和成纤维细胞并共培养，用细胞因子IL-2 和 IL-7 维持 ILC2 的存活，用 IL-33 激活 ILC2。在共培养后进行天狼星红染色，结果显示在与活化的ILC2共培养的成纤维细胞中胶原蛋白的产生增强，同时，在IL-33激活的ILC2存在下，从成纤维细胞中洗脱出天狼星红染料测得的吸收率增加，表明ILC2s直接诱导成纤维细胞的胶原生成。

Result 8.来自IPF个体的ILC2显示出与来自Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠的ILC2相似的表型

       作者分析了 IPF 个体中的 ILC2，对从 12 名健康志愿者和 19 名 IPF 个体中分选的外周血 ILC2 进行RNA-seq 分析，并用PCA将IPF个体的ILC2与健康对照的ILC2区分开，与健康对照组相比，对IPF患者ILC2s中高表达的基因本体富集分析。之后，作者分析了促进PF的基因的表达，发现IL5、IL13和IL1RL1在IPF个体的ILC2中表达显著上调，而且IPF 患者 ILC2 中 IFNGR1 的表达显著降低，这些数据共同表明ILC2在IPF个体中被激活，这与在Ifngr1-/-Rag2-/-小鼠中观察到的机制一致。

       综上所述，IFNγ信号传导的缺乏导致ILC2在炎症期过度激活，并加速成纤维细胞中的胶原蛋白的生成，此外，研究结果证明了在 PF 的初始阶段，靶向 ILC 的治疗干预可能会减轻纤维化的进展。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-43336-6